使用1 mL吸量管將培養基小心移除，直到試管中沒有剩餘的培養基。 將細胞在液態氮中急速冷凍並儲存在-80℃下以供未來使用。 將一小瓶的冷凍iPSC（來自基於滋養細胞或無滋養細胞之培養）在37℃水浴中快速解凍。 將小瓶內容物逐滴添加至50 mL錐形管中，試管含有25 mL的StemFit Basic 2.0培養基（針對基於滋養細胞之培養）或含有10 µM ROCK抑制劑之mTeSR培養基（針對無滋養細胞之培養）。 重要的是要確保細胞係逐滴添加，因為將細胞突然添加至培養基中將會造成滲透性休克。
- 如實施例B1至B25中任一者之方法，其中所生產之該等iPSC的基因組係穩定的且無染色體損失。
- 在體內，Bcl-2預防淋巴及神經發育期間發生之許多（但非所有）形式的凋亡性細胞死亡。
- 在某些實施例中，其中經單離細胞群係在活化培養物中培養不長於一段特定時間。
- 在某些實施例中，細胞係維持於培養物中12至48小時。
- 在一些實施例中，造血系統之過度增生性病症係真性紅血球增多症、原發性血小板增多症、骨髓纖維化伴骨髓化生、或慢性骨髓性白血病。
該用語亦包括自當在非自然發生環境中發現細胞時會有的至少一種、一些、或所有組分中移出之細胞。 因此，經單離細胞係與當在自然中發現其時或當其係在非自然發生環境中生長、儲存、或生存時會有的其他物質部分或完全分離。 經單離細胞之具體實例包括部分純的細胞、實質上純的細胞、及培養於非自然發生之培養基中的細胞。 如本文中所使用，用語「外源」意欲意指所指稱之分子或所指稱之活性被引入宿主細胞中。 分子可例如藉由將編碼核酸引入宿主基因材料中（諸如藉由整合至宿主染色體中或作為非染色體基因材料，諸如質體）而引入。 因此，當該用語用於指稱編碼核酸之表現時，該用語係指將呈可表現形式之編碼核酸引入細胞中。
在某些實施例中，所生產之iPSC的基因組係穩定的且無染色體損失。 在某些實施例中，所生產之iPSC的基因組穩定性係藉由核型分析判定。 在某些實施例中，所生產之iPSC在過繼後可生長於無滋養細胞之培養基中。 IdentiClone T細胞受體γ基因重排檢定2.0 PCR檢定採用多種共通DNA引子，其靶向T細胞受體γ鏈基因內之保守基因區。
在某些實施例中，經單離iPSC群不會生產來自TCRA及TCRB基因座之PCR產物。 在某些實施例中，經單離iPSC群係衍生自γδ T細胞。 在某些實施例中，經單離iPSC群具有TRG及TRD基因座之重排基因。 在某些實施例中，經單離iPSC群不會生產來自TCRG及TCRD基因座之PCR產物。 在一替代性實施例中，外源引入之多能性基因可暫時轉染至細胞中，個別地或作為cDNA表現庫（製備自多能細胞）之一部分。 此類多能細胞可係胚胎幹細胞、卵母細胞、囊胚細胞、內細胞團細胞、胚胎生殖細胞、類胚體（胚）細胞、桑椹胚衍生細胞、畸胎瘤（畸形癌）細胞、及在胚胎發育過程後期取得之多潛能經部分分化胚胎幹細胞。
此外，可將藉由X物種核轉移(X-species 副甲狀腺荷爾蒙 nuclear transfer)生產之內細胞團與提供3維組織形成之生物可分解、生物相容性聚合物基質一起引入。 在組織形成後，聚合物會降解，從而理想地只留下供體組織，例如心臟、胰臟、神經、肺、肝。 在一些情況下，可能有利的是包括促進血管生成之生長因子及蛋白質。
在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養12至24小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養8至16小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養4至8小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養2至4小時。 如請求項1至26中任一項之方法，其中所生產之該等iPSC不會生產來自TCRA及TCRB基因座之聚合酶連鎖反應產物。 如請求項1至17中任一項之方法，其中該一或多種重編程因子係選自由下列所組成之群組：OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28、及c-Myc。
使用安裝於200 副甲狀腺荷爾蒙 µL吸量管上具有加長口部的凝膠加載吸管尖使所有經分化群落選擇性地鬆脫。 將盤用2 mL的StemFit Basic2.0培養基（針對基於滋養細胞之培養）或mTeSR培養基（針對無滋養細胞之培養）洗滌，接著用真空泵將培養基吸出。 在這兩次洗滌後，將大部分鬆脫的經分化群落自盤中取出。 本發明方法適用於識別活化至少兩種內源多能性基因在體細胞中表現之基因。 用於該等方法中之體細胞進一步包含連接至第二可選擇標記之第二內源多能性基因。 該等方法可經修改以選擇出表現這兩種可選擇標記之經轉染細胞，其中對第一及第二內源多能性基因之表現進行評估。
換言之，如本文中所使用，用語「重編程」涵蓋細胞之分化狀態沿著譜朝向較低分化狀態的任何移動。 例如，重編程包括將多潛能細胞反轉回多能細胞、將終末分化細胞反轉回多潛能細胞或多能細胞。 在一個實施例中，體細胞之重編程會將體細胞一路轉回多能狀態。 在另一實施例中，體細胞之重編程會將體細胞轉回多潛能狀態。
將含有10 µM ROCK抑制劑(cat # SCM075, Merck Millipore)及bFGF之2 mL的StemFit Basic2.0培養基添加至孔中。 在接種經SeV轉導細胞-細胞團塊富集之PBMC或γδ T細胞當天，將6孔盤用層黏蛋白511-E8片段塗佈（用iMatrix-511塗佈盤之詳細規程係描述於第7.2.1節中）。 將細胞及培養基自培養盤取出並轉移至15 mL falcon試管中。 將盤中之孔用1 mL的完全RPMI培養基(RPMI + 10% FBS+1x Pen/Strep)溫和潤洗，以確保採集到大部分的細胞。
小有機化合物之組合庫可包含密切相關類似物之集合，該等類似物彼此在一或多個多樣性點上有所不同，且係藉由有機技術使用多步驟程序合成。 如本文中所使用，「化合物陣列」係化合物之集合，該等化合物可藉由其等在笛卡兒座標中之空間位址識別，且其等經排列使得各化合物具有一個共同分子核心及一或多個可變結構多樣性元素。 此化合物陣列中之化合物係在分開的反應容器中並行生產，且各化合物係藉由其空間位址來識別及追蹤。
在一些實施例中，本文中所提供之篩選方法係用於識別在將細胞重編程為多能狀態時取代Klf4之試劑或試劑組合。 在一些實施例中，該方法係用於識別在將細胞重編程為多能狀態時取代Sox2之試劑。 在一些實施例中，該方法係用於識別在將細胞重編程為多能狀態時取代Oct3/4之試劑。 在一些實施例中，該方法係用於識別在將細胞重編程為多能狀態時取代c-Myc之試劑。 在一些實施例中，該方法係用於識別在將細胞重編程為多能狀態時取代Lin28之試劑。 在一些實施例中，該等方法係使用人類細胞實施。
如實施例C1至C3中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群並非衍生自αβ T細胞。 如實施例C1至C3中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群不會生產來自TCRA及TCRB基因座之PCR產物。 如實施例C1至C7中任一者之經單離iPSC群，其中該經單離iPSC群的基因組係穩定的且無染色體損失。
因此，使用已知方法及培養基，所屬技術領域中具有通常知識者可培養對象胚胎或類幹細胞以獲得所欲經分化細胞類型，例如神經細胞、肌肉細胞、造血細胞等。 此外，使用誘導性Bcl-2或Bcl-x1可能對於增強特定細胞譜系之體外發育是有用的。 副甲狀腺荷爾蒙 在體內，Bcl-2預防淋巴及神經發育期間發生之許多（但非所有）形式的凋亡性細胞死亡。 Bcl-2表現可能如何用於在供體細胞轉染後抑制相關細胞譜系之細胞凋亡的深入討論係揭示於美國專利第5,646,008號中，其以引用方式併入本文中。 本揭露亦關於將屬於多能性相關基因之內源基因座引入經活化細胞群中。
在某些實施例中，經單離細胞群係哺乳動物細胞。 在IHC研究中使用抗山羊IgG NorthenLights螢光557接合抗體(cat # NL001, R&D Systems)作為二級抗體。 其等對於光漂白具有抗性，因而對於多重染色 IHC研究而言是理想的。 執行基因組PCR以評估TRG及TRD基因座處之重排。 將單離自iPSC群落（如上所述）之基因組DNA用作為模板。 在新的微量離心管中，藉由將混合物充份漩渦震盪，將適當量（針對ROX大小標準品為10 µL而針對LIZ大小標準品為9.5 µL）的PCR反應產物與Hi-Di甲醯胺及ROX或LIZ大小標準品混合。
- 採集第3天或第8天Zol培養之PBMC，並在室溫下將其以1500 rpm離心沉降5 min。
- 在某些實施例中，在活化培養物中培養第一段時間後，經單離細胞群中之γδ T細胞包含5%至25% TCRVγ9+ T細胞。
- 實體腫瘤係組織之異常團塊，其通常不含有囊腫或液態區域。
- 在一些實施例中，重編程亦涵蓋將體細胞之分化狀態部分反轉為多潛能狀態。
- 該等方法經修改以選擇出表現所有三種可選擇標記之經轉染細胞，其中對所有三種內源多能性基因之表現進行評估。
- 需要劇烈洗滌以移除任何殘餘的絲裂黴素C，因為如果有殘餘的絲裂黴素C存在將會防止任何共培養細胞之增生。
- 用語「內源」係指存在於宿主細胞中的所指稱之分子或活性。
例如，用胸苷激酶基因轉染之供體細胞將導致含有TK基因之胚胎細胞的生產。 這些細胞之分化將導致亦表現TK基因之所關注治療性細胞的單離。 在投予更昔洛韋後，可在任何時候選擇性地將此類細胞自患者中消除。 此負向選擇系統係描述於美國專利第5,698,446號中並以引用方式併入本文中。 如本文中所使用，「多能性誘導基因」係指其表現促成將體細胞重編程為多能狀態的基因。 「多能性誘導因子」係指多能性誘導基因之表現產物。
如實施例A21或A22之方法，其中該滋養層包含小鼠胚胎纖維母細胞。 如實施例A1至A23中任一者之方法，其進一步包含單離及/或純化所生產之該等iPSC。 如實施例A24之方法，其進一步包含向對象投予經單離之該等iPSC。 如實施例A1至A24中任一者之方法，其進一步包含將該等iPSC離體分化為所欲細胞類型之細胞。 如實施例A26之方法，其進一步包含向對象投予經分化之該等細胞。
在一些實施例中，該等方法係使用小鼠細胞實施。 在一些實施例中，該等方法係使用非人類靈長類細胞實施。 在一些實施例中，IL-15、唑來膦酸、及/或IL-2、及候選試劑係一起存在於細胞培養基中，而在其他實施例中，IL-15、唑來膦酸、及/或IL-2、及候選試劑並非一起存在（例如，細胞係依序暴露於該等試劑）。 在某些實施例中，細胞係維持於培養物中1至20天。 在某些實施例中，細胞係維持於培養物中1至17天。
重要的是確保在將顯微鏡移至層流櫃中前，顯微鏡係乾淨的且經過消毒。 副甲狀腺荷爾蒙 調整顯微鏡以對焦在預先標記的群落上，使用安裝於200 µL吸量管上具有加長口部的凝膠加載吸管尖來回刮削。 將細胞-細胞團塊（或母細胞）用編碼OCT3/4、SOX2、KLF4、及c-Myc重編程因子之仙台病毒載體轉導。 使經SeV載體轉導之細胞在有絲分裂去活化之MEF滋養層、T細胞耗竭之自體PBMC、及/或無滋養細胞條件上繁殖，如以下於第7.2.1節至第7.2.5節中所述。
此外，可投予經重編程上皮細胞以修復體腔或器官內膜（諸如肺、腸道、外分泌腺、或泌尿生殖道）之損傷。 亦設想到，可向哺乳動物投予iPSC以治療器官（諸如膀胱、腦、食道、輸卵管、心臟、腸、膽囊、腎、肝、肺、卵巢、胰臟、前列腺、脊髓、脾臟、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、氣管、輸尿管、尿道、或子宮）中之細胞損傷或不全。 在具體實施例中，醫藥組成物係提供於一次性容器（例如，一次性小瓶、安瓿、注射器、或自動注射器）中。 在一具體實施例中，醫藥組成物係提供於多次使用容器（例如，多次使用小瓶或卡式瓶）中。
此類調配劑包括例如在製備持續釋放或控制釋放配方方面所屬技術領域中具有通常知識者已知之物質。 關於醫藥上可接受之調配劑，參見例如 Remington’s Pharmaceutical 副甲狀腺荷爾蒙 Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042)第1435至1712頁、及 The Merck Index, 12th Ed. 在某些實施例中，在以上方法中所述之步驟中，經轉導γδ T細胞係於一或多個滋養層存在下培養。 在某些實施例中，在步驟中經轉導之γδ T細胞係於單層的滋養層存在下培養。
在一個實施例中，經基因工程改造之免疫細胞的經單離群或亞群包含iPSC衍生前NK細胞或NK細胞。 在一個實施例中，經基因工程改造之免疫細胞的經單離群或亞群包含iPSC衍生免疫調節細胞或骨髓衍生抑制細胞。 在一些實施例中，iPSC衍生經基因工程改造之免疫細胞經進一步離體調節以改善治療潛能。 此外，可將根據本揭露生產之iPSC引入動物中，例如SCID小鼠、牛、豬，例如在腎囊下或肌肉內，並用於在其中生產畸胎瘤。
在某些實施例中，第一段時間係55至75小時。 在某些實施例中，第一段時間係60至75小時。 在某些實施例中，第一段時間係70至75小時。 在某些實施例中，第一段時間係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20天。 如本文中所使用，用語「經單離」或類似者當用於指稱細胞時，其意欲意指細胞實質上不含至少一種當在自然中發現所指稱之細胞時會有的組分。 該用語包括自當在細胞自然環境中發現細胞時會有的一些或所有組分中移出之細胞。