篩選抗癌劑的方法係基於本發明之新穎揭示，其中抑制KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之活性或表現可抑制癌細胞逃避T細胞的功能。 本發明之篩選方法極其有利，係因其容許通過簡單且廉價的方法，輕鬆地開發新穎之抗癌劑。 在一具體實施例中，相較於未以KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑處理的癌細胞，KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑可減少癌細胞中KIRREL3、CNTN4、及/或CD351的表現。 KIRREL3、CNTN4、及/或CD351的表現減少，可指由KIRREL3、CNTN4、及/或CD351基因產生之mRNA及/或蛋白質下降或無表現量。
其中，上述用以培養毒殺型樹突細胞的配方包含有效量之至少一細胞激素，且上述細胞激素為介白素15號。 在本發明之一實施例中，本發明所提供之配方更包含有效量之另一細胞激素，且上述另一細胞激素為介白素12號。 更進一步，介白素15號的濃度為10 ng/mL，介白素12號的濃度為0.5-20ng/mL。 利用本發明所提供之配法可將人類血液檢體中之毒殺型樹突細胞的數量擴增200至400倍。 本發明之另一態樣為提供受試者一種治療或預防癌症的方法，其包含投予受試者一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑。
副甲狀腺癌: TWI526538B – 培養毒殺型樹突細胞的配方及其方法
抗體不僅可包括具有包含二重鏈與二輕鏈之全長形式，還包括抗體分子之功能性片段，只要其能特異地結合至KIRREL3、CNTN4、及CD351之一或多者。 抗體分子之功能性片段意指具有至少其抗原結合功能之片段，且可包括但不侷限於，Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv等。 「一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑」乙詞意指抑制至少一選自於KIRREL3、CNTN4、及CD351之活性或表現的物質。 「一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑」及「KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑」可互換使用。
在體內方法中，以候選抗癌劑處理癌細胞之步驟，可以投予具有癌細胞或患有癌症之受試者一候選抗癌劑之步驟代替。 利用本領域習知之方法，口服投予製劑可製成粉末、顆粒、片劑、丸劑、糖衣丸劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等形式。 舉例而言，本發明之活性成分可與適用之賦形劑及/或佐劑混合，之後加工成顆粒混合物，以得到口服之片劑或糖衣片劑。 任意地，可加入崩散劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸、或海藻酸鈉。 此外，本發明之醫藥組合物可進一步包含抗凝劑、潤滑劑、潤濕劑、芳香劑、乳化劑、及防腐劑等。
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或者，KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑特異地結合至KIRREL3、CNTN4、及/或CD351蛋白質，並干擾KIRREL3、CNTN4、及/或CD351結合至T細胞。 或者，KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑抑制KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之特定代謝途徑，以減少蛋白質之表現，或造成KIRREL3、CNTN4、及/或CD351變性，以使蛋白質失去其活性。 因此，本發明之KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑在治療或預防癌症上極有效。 然而，必須說明的是，在一較佳實施例中，上述配方雖更可包含介白素12號，但僅包含有介白素15號的配方已可達到良好之培養效果，不僅如此，此配方一定要具有介白素15號，加入介白素12號是可更進一步加強其放大培養效果。 請參考第五A至五D圖，第五A至五D圖分別顯示加入培養基(對照組)、介白素12號、介白素15號與介白素15號搭配介白素12號，培養毒殺型樹突細胞至第三天的結 果。
第二十一圖A、第二十一圖B、第二十一圖C、及第二十一圖D顯示以CD351抑制劑處理白血病細胞株U937與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十九圖A、第十九圖B、第十九圖C、及第十九圖D顯示以CD351抑制劑處理乳癌細胞株MDA-MB-231與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十八圖A、第十八圖B、第十八圖C、及第十八圖D顯示以CD351抑制劑處理結腸癌細胞株HCT-116與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。
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第十七圖A、第十七圖B、第十七圖C、及第十七圖D顯示以CD351抑制劑處理肺癌細胞株A549與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十五圖A、第十五圖B、第十五圖C、及第十五圖D顯示以CNTN4抑制劑處理胃癌細胞株MKN-74與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十四圖A、第十四圖B、第十四圖C、及第十四圖D顯示以CNTN4抑制劑處理乳癌細胞株MDA-MB-231與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十三圖A、第十三圖B、第十三圖C、及第十三圖D顯示以CNTN4抑制劑處理結腸癌細胞株HCT-116與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十二圖A、第十二圖B、第十二圖C、及第十二圖D顯示以CNTN4抑制劑處理肺癌細胞株A549與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。
在本發明之一實施例中，其中上述去除週邊血單核細胞群組中的T細胞與B細胞的步驟係藉由一流式細胞檢測技術來完成，且其步驟為：檢測週邊血單核細胞群組中之B細胞表面標記與T細胞表面標記的表現。 在本發明之一實施例中，其中上述取得人類血液檢體之周邊血單核細胞群組的步驟中，包含下列步驟。 首先，收集該人類血液檢體，並以同體積磷酸緩衝液兩倍稀釋人類血液檢體。 接著，自人類血液檢體中分離出週邊血單核細胞群組，並去除週邊血單核細胞群組中的T細胞與B細胞。 承上所述，本發明提供一種培養毒殺型樹突細胞的配方，包含有效量之至少一細胞激素，且上述細胞激素為介白素15號。 因此，發明人進一步地研發出培養此種毒殺型樹突細胞的配方及其培養方法，運用本發明所提供的方法能使週邊血中微量的毒殺型細胞擴增至200至400倍，將使毒殺型樹突細胞在癌症免疫療法的研究及應用上具有重大性的突破。
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請參考第一圖至第二B圖，第一圖顯示健康者與癌症患者在週邊血中毒殺型樹突細胞含量百分比對照圖，第二A圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀分析癌症患者週邊血的結果，第二B圖顯示本發明一實施例中藉流式細胞儀分析健康者週邊血的結果。 如第一圖所示，在癌症患者的週邊血中毒殺型樹突細胞的含量百分比明顯低於健康者。 另外，如第二A圖所示，請見右上角處，癌症患者所提供的週邊血中毒殺型細胞群組10內細胞的含量只有百分之0.0367，而如第二B圖所示，同樣請見右上角處，在健康者所提供的週邊血中毒殺型細胞群組10內細胞的含量為百分之0.436，明顯高於癌症患者。 另外，本發明所揭示的培養方法中的多個分離或篩選步驟均藉由一流式細胞檢測技術(即流式細胞儀)來完成，並適合使用各一或多種流式細胞儀來利用不同群組的細胞擁有不同的細胞表面標記物區分篩選出目標細胞群組。 流式細胞儀能夠以遠遠超過相關技藝任何其他單細胞分析技術之速度實施單細胞分析，相比於使用其他替代技術能夠較快速地分析統計學上有意義之數量的細胞，但本發明並不欲以此為限。
- 流式細胞儀能夠以遠遠超過相關技藝任何其他單細胞分析技術之速度實施單細胞分析，相比於使用其他替代技術能夠較快速地分析統計學上有意義之數量的細胞，但本發明並不欲以此為限。
- 據此，本發明所提供之培養毒殺型樹突細胞的配方係包含細胞激素，且此處所指的細胞激素可為單獨使用有效量之介白素15號，或同時使用有效量之介白素15號與介白素12號，本發明並不欲以任一實施例為限。
- 如第六B圖與第六C圖所示，隨這培養天數增加，細胞群20會增生並往右上角移動，也就是轉變成同時具有自然殺手細胞表面標記(CD56+)與樹突細胞表面標記(HLA-DR+)的的毒殺型樹突細胞10。
- 較佳地，上述步驟S107係藉由一流式細胞檢測技術完成，但本發明並不欲以任一方法為限。
- 雖然許多惡性腫瘤都有抗癌療法，但這些治療通常無法完全控制這類惡性腫瘤，或對所有病患皆無效。
- 本實施例旨在確認，當以KIRREL3、CNTN4、或CD351抑制劑中和KIRREL3、CNTN4、或CD351時，是否增加PBMC對癌細胞的細胞毒性能力。
較佳地，在一個實施例中，使用帶有熟習此項技術者習知之任一適宜試樣製備自動裝置或液體處理器的流式細胞儀。 另外，使用單路雷射流式細胞儀或多路雷射流式細胞儀來實施分析步驟均可，本發明並不欲以此為限。 較佳地，大量螢光染料及偶聯化學品之研發及最佳化使得能夠將諸如免疫球蛋白及小分子等各種配體偶聯至螢光染料。 具有介於光譜之紫外至紅光區範圍內之發射線的雷射能夠激發該等螢光染料。 因此，可使用諸多光譜學上不同之試劑來標記細胞以利用基於螢光之測試方法(如本發明所使用之流式細胞儀)進行研究。 在一些實施例中，在細胞對藥物組合物之效應的分析中使用一或多種染色劑。
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如請求項6所述之用於增強免疫的醫藥組合物，其中該受試者有預防、治療、或改進與免疫缺陷、免疫功能下降、免疫系統損傷、或免疫功能受損相關之疾病的需求。 將數目3×104個細胞的癌細胞加入實施例2.1製備之含有PBMC之96孔培養盤各孔中，其體積為100 μL。 相較於以IgG1處理之對照組及以PD-L1處理之對照組，以CD351處理之組別明顯抑制CD4+ T細胞與CD8+ T細胞之增生。 相較於以IgG1處理之對照組，以CNTN4處理之組別明顯抑制CD4+ T細胞與CD8+ T細胞之增生。 同時，CNTN4處理組之CD4+ T細胞與CD8+ T細胞之增生抑制，類似於以PD-L1處理之對照組。
經由本發明所提供之配方及方法可在體外從人類週邊血中將微量的毒殺型樹突細胞放大200至400倍。 況且，本發明中所使用的人類週邊血係來自於癌症患者，如第一圖所示，癌症患者的週邊血中毒殺型樹突細胞的含量更少，也就是說本發明的技術即使毒殺型樹突細胞是微量中的微量也可以放大，加速毒殺型樹突細胞的研究及應用。 首先，如第三圖所示，先取得人類血液檢體之週邊血單核細胞群 組S100。
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記憶的功能使免疫系統對已對付過的抗原，引發強而快速的次發反應，可將外來危害因子有效去除。 第二十圖A、第二十圖B、第二十圖C、及第二十圖D顯示以CD351抑制劑處理胃癌細胞株MKN-74與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 相較於未處理對照組，在KIRREL3、CNTN4、或CD351減量的組別中，明顯抑制小鼠腫瘤生長率。 此意指，當阻斷或減量KIRREL3、CNTN4、及CD351之一或多者以抑制其活性或表現時，延遲或停止癌症的發展，且抑制癌症發生。 據此，一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑可有效用於預防癌症。
- 干擾素分泌型殺手樹突細胞可以從毒殺目標、抗原呈現到活化T細胞都由自己完成，亦即干擾素分泌型殺手樹突細胞找到目標後會毒殺目標，接著把碎片吞噬後呈現抗原給T細胞，並活化T細胞。
- 抗癌及增強免疫的新穎標的 本申請案係主張2018年4月5日提申的美國專利申請號62/652,948之優先權，其揭示內容在此併入本案以作為參考資料。
- 首先，事先說明的是，如前文所述發明人經過長年的努力以及無數次的試驗，已成功篩選出了人類體內同時具有毒殺及抗原呈現功能的細胞，並定義該細胞為毒殺型樹突細胞，即係具有包含有細胞表面標記為HLA-G-CD14-CD19-CD3-CD56+HLA-DR+的細胞。
- 較佳地，大量螢光染料及偶聯化學品之研發及最佳化使得能夠將諸如免疫球蛋白及小分子等各種配體偶聯至螢光染料。
- 「shRNA (短髮夾型RNA)」乙詞意指單股RNA，包含一莖部分，其經由氫鍵形成雙股部分，以及一環部分。
測定FL-1 與FL-3 (7-AAD)染色，以分析PBMC對癌細胞之細胞毒性，其使用FACSDiVa軟體。 本實施例旨在確認，當以KIRREL3、CNTN4、或CD351抑制劑中和KIRREL3、CNTN4、或CD351時，是否增加PBMC對癌細胞的細胞毒性能力。 這意指，若以阻斷或減量方式中和CD351，則可阻止CD351的T細胞增生抑制作用。
副甲狀腺癌: TWI526538B – 培養毒殺型樹突細胞的配方及其方法
NK細胞表面雖然沒有抗原專一性受體，但其表面有許多其他的膜蛋白接受來自目標細胞的刺激，以調節NK細胞的活性，這些膜蛋白大致可分為「抑制性受體」和「活化性受體」。 當NK細胞與細胞接觸後，獲得活化性受體的訊息，若與正常細胞接觸，則正常細胞表面的第一型MHC分子與抑制性受體結合，傳遞了「抑制」NK細胞活性的訊息，故NK細胞不會被活化，以避免殺死正常細胞。 若正常細胞被病毒感染或轉為腫瘤細胞後，第一型MHC分子的表現常會發生異常，因此當NK細胞接觸不正常細胞時，便無法獲得抑制性受體的訊息，於是NK細胞便活化進行胞殺作用。
舉例而言，在本發明中，預後意指治癒癌症病患或改進癌症病患病情之可能性。 「miRNA (微RNA)」乙詞意指21至23個非編碼之RNAs，其在轉錄後調控基因表現，係藉由促進標的RNA之降解或抑制其轉譯。 抗癌及增強免疫的新穎標的 本申請案係主張2018年4月5日提申的美國專利申請號62/652,948之優先權，其揭示內容在此併入本案以作為參考資料。
副甲狀腺癌: TWI766155B – 抗癌及增強免疫的新穎標的
SiRNA包含一正義RNA鏈，其具有與標的基因之mRNA同源的序列，以及一反義RNA鏈，其具有與其互補的序列。 副甲狀腺癌 副甲狀腺癌 SiRNA可抑制標的基因的表現，因此可用於基因剔除、基因治療等等。 另外，介白素15號較佳地濃度為10ng/mL，但在發明人的實驗中，介白素15號的濃度大於1ng/mL即可有放大培養毒殺型樹突細胞的效果，而較佳地介白素12號濃度介於0.5-20 ng/mL之間。
副甲狀腺癌: TWI766155B – 抗癌及增強免疫的新穎標的
一種在一受試者中用於增強免疫的醫藥組合物，其包含一或多個KIRREL3、CNTN4、及CD351之抑制劑。 副甲狀腺癌 第十六圖A、第十六圖B、第十六圖C、及第十六圖D顯示以CNTN4抑制劑處理白血病細胞株U937與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第十一圖A、第十一圖B、第十一圖C、及第十一圖D顯示以KIRREL3抑制劑處理白血病細胞株U937與PBMC時，PBMC的細胞毒性(%)。 第二十二圖提供未處理對照組與KIRREL3減量之第八組小鼠的腫瘤大小結果。
副甲狀腺癌: TWI526538B – 培養毒殺型樹突細胞的配方及其方法
本發明提供一種用於治療或預防癌症的醫藥組合物，其包含KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑。 此外，本發明提供一種用於增強免疫的醫藥組合物，其包含KIRREL3、CNTN4、及/或CD351之抑制劑。 此外，本發明提供一種利用KIRREL3、CNTN4、及/或CD351篩選抗癌劑的方法，以及一種提供利用KIRREL3、CNTN4、及/或CD351分析癌症預後所需資訊的方法。 接著，將藉由第六A至六C圖以及第七圖來說明經由本發明所提供之配方與方法而大量製備毒殺型樹突細胞的實驗結果。