圖11J顯示在第2、4及10週齡以人類設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的mRNA含量。 為了調查小鼠特異性基因轉移／基因編輯AAV載體（PAH-006m-LP-1；“小鼠設計”）及人類特異性基因轉移／基因編輯AAV載體（hPAH-hI1C-032-LP1-SD3；「人類設計」）之間的劑量範圍差異，用於一面對面的研究中。 圖9A及9B顯示如前所述之被投與劑量之小鼠中血清Phe含量的12週時程。 如同所示，在接收封裝於AAVHSC15衣殼內之游離轉基因表達載體（圖9A）或封裝於AAVHSC15衣殼內之基因轉移／基因編輯載體（圖9B）之小鼠中觀察到血清Phe減少。
作為陽性控制組，使用小鼠特異性PAH基因座探針及用於同源插入位點的探針之間的連鎖。 在圖6中，An.1 HS係指動物1智人細胞、An.1 MM係指動物1家鼷鼠細胞、An.1 MM Pos.係指動物1家鼷鼠陽性控制組、An.2 HS係指動物2智人細胞、An.2 分子療法 MM係指動物2家鼷鼠細胞及An.2 MM Pos.係指動物2家鼷鼠陽性控制組。 圖7顯示如經由橫跨左右同源臂的定量NGS測定法所測量之人類肝細胞的編輯。 未處理之人類DNA與作為負控制組之PAH-032h載體混合。 在一個態樣中，本文提供新穎rAAV組成物，其用於在具有降低的或以其他缺乏PAH基因功能之細胞中恢复PAH表達。 這種rAAV組成物有效地編輯在個體中的細胞（例如肝細胞）基因體，以在肝臟特定啟動子的控制下表現PAH，而不需要通過外源性核酸酶（例如巨核酸酶、鋅指核酸酶、類轉錄活化因子核酸酶、或RNA引導的核酸酶如Cas9）的作用在靶基因座的基因體裂解來促進這種編輯。
相鄰的序列也被長讀取序列所涵蓋，以判定所讀取的來源是來自野生型、整合或載體基因體。 包含基因體DNA及經緘默改變hPAH轉基因的連續序列被歸類為整合等位基因，而僅包含基因體DNA但在靶整合位點沒有經緘默改變hPAH轉基因的序列被歸類為野生型等位基因。 整合序列百分比計算為：映射至整合參考之讀取數目除以映射至整合參考之讀取、映射至野生型參考之讀取及映射至載體基因體多聯體之讀取的總數目。
如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸，其用於治療患有PKU之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之該rAAV、該醫藥組成物或該多核苷酸。 分子療法 一種用於治療患有苯丙酮尿症之個體的方法，該方法包含向該個體施用有效量之如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸。 如請求項1至41中任一項之rAAV，其中該5’及3’同源臂核苷酸序列中的每個獨立地具有約100至約2000之核苷酸長度。
本文提供的rAAV組成物特別有利，在於它們可有效地編輯個體的細胞（例如肝細胞）基因體，以在肝臟特定啟動子的控制下表達PAH，從而提供PKU患者一種潛在的治癒機會。 如請求項74至77中任一項之封裝系統，其中該第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群組的病毒之基因：腺病毒、疱疹病毒、痘瘡病毒及細胞巨大病毒（CMV）。 一種用於治療患有異染性白質失養症（MLD）之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之rAAV，該rAAV包含： （a）AAV衣殼，其包含衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。 在封裝系統之某些具體實施例中，輔助病毒係選自由以下組成之群組：腺病毒、疱疹病毒（包括單純疱疹病毒（HSV））、痘病毒（諸如痘瘡病毒）、細胞巨大病毒（CMV）及桿狀病毒。 在封裝系統之某些具體實施例中，其中輔助病毒為腺病毒，腺病毒基因組包含一或多種選自由以下組成之群組之腺病毒RNA基因：El、E2、E4及VA。 在封裝系統之某些具體實施例中，其中輔助病毒為HSV，HSV基因組包含選自由以下組成之群組之HSV基因中之一或多者：UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及UL30/UL42。
如請求項1至34中任一項之rAAV，其中該5’同源臂核苷酸序列與該第一基因體區域至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。 圖 13A 及 分子療法 13B顯示為封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3分別對每ug基因體DNA所檢測到之載體基因體含量及自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中每10 ng總RNA所檢測到的mRNA表達含量的影響的圖。 圖 13C顯示為，依所指定劑量給予封裝於AAVHSC15之hPAH-hI1C-032-LP1-SD3後於不同時間點自HuLiv小鼠分離的人類肝細胞中所檢測到靶上插入頻率的圖。
投與1E+14 vg/kg劑量之動物子集在第2週時間點犧牲，以測量在肝臟中靶基因插入含量。 圖8A顯示全數據集，而圖8B顯示至12週具有減少的y軸刻度的數據，以允許更清晰地看到劑量含量之間的差異。 血液Phe濃度在施用所有劑量含量一週後減少至正常含量，其中1E+14及2E+14之劑量導致最低含量。
鞘脂激活蛋白原（PSAP）基因編碼高保守性前原蛋白，該前原蛋白經蛋白水解處理以產生四種主要裂解產物，包括鞘脂激活蛋白A、B、C及D。 前驅蛋白質之每個結構域之長度為約80個胺基酸殘基，且具有幾乎相同的半胱胺酸殘基及糖基化位點之佈置。 鞘脂激活蛋白A-D主要位於溶酶體隔室，其在溶酶體隔室中促進具有短寡醣基團之鞘醣脂之分解代謝。 前驅蛋白質以分泌蛋白質及整合膜蛋白質兩者之形式存在且具有神經營養活性。
啟動子及增強子元件不需要衍生自相同基因或物種，且各啟動子或增強子元件之序列可與基因體中之對應內源性序列一致或實質上一致。 如本文所用，術語「rAAV基因體」係指重組AAV基因體，其能夠通過同源重組將編輯元件（例如一或多種核苷酸或核苷酸間鍵合）整合至靶基因座以校正PAH基因內的遺傳缺陷。 熟悉此項技術者應瞭解，包含5’同源臂、編輯元件及3’同源臂之rAAV基因體的部分可以是相對於靶基因座（例如人類PAH基因）的正義或反義方向。 一種rAAV，其包含： （a）AAV衣殼，其包含AAV衣殼蛋白質；及 （b）轉移基因組，其包含可操作地連接至以緘默方式改變之ARSA編碼序列之轉錄調節元件。 圖 9A為顯示在以所指示之劑量向ARSA（-/-）小鼠靜脈內投與封裝於AAVHSC15衣殼中之轉移載體pHMI-5000之後，在腦部中實現之正常hARSA活性之百分比之圖。
如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含該基因組的5’之5’反向末端重複（5′ ITR）核苷酸序列，及該基因組的3’之3’反向末端重複（3′ ITR）核苷酸序列。 如前述請求項中任一項之方法，其中該轉移基因組進一步包含位於該以緘默方式改變之ARSA編碼序列3’之填充序列。 在封裝系統之某些具體實施例中，第一、第二及/或第三載體包含於一或多種重組輔助病毒內。 在某些具體實施例中，第一載體及第三載體包含於重組輔助病毒內。 在某些具體實施例中，第二載體及第三載體包含於重組輔助病毒內。 或者，TRE可為組織特異性TRE，亦即，其在特定組織及/或器官中具有活性。
此引起獲得性功能及/或技能之喪失、低張症、共濟失調、癲癇、失明、聽力喪失及過早地死亡。 如請求項1至70中任一項之rAAV、如請求項71之醫藥組成物或如請求項72之多核苷酸，其用於治療PKU。 如請求項22之rAAV，其中該聚腺苷酸化序列為外源性聚腺苷酸化序列，視情況其中該外源性聚腺苷酸化序列為SV40聚腺苷酸化序列。 如請求項17之rAAV，其中該內含子元件為外源性內含子元件，視情況其中該外源性內含子元件為SV40內含子元件。
在爲期12周的研究期間，減少之血液Phe含量維持在＜360 μM。 最近已產生新的治療策略，包含大型中性胺基酸補充劑、輔因子四氫生物喋呤療法、酶置換療法及遺傳修飾益生菌療法。 藉由施用PAH替代物（例如苯丙胺酸脫氨酵素）之酶置換，可導致免疫反應進而減低療效及/或引起副作用。 至於遺傳修飾益生菌療法，表達PAL之大腸桿菌的致病性已經是一個問題。
在某些具體實施例中，待轉導之細胞在哺乳動物個體中且以可有效轉導個體中之細胞之量向個體投與AAV。 因此，在某些具體實施例中，本發明提供一種用於治療患有與ARSA基因突變相關之疾病或病症的個體之方法，該方法通常包含向個體投與有效量之如本文中所揭示之rAAV。 個體可為具有ARSA突變之人類個體、非人類靈長類動物個體（例如食蟹獼猴）或嚙齒動物個體（例如小鼠）。
外源聚腺苷酸化序列可為哺乳動物或病毒聚腺苷酸化序列（例如SV40聚腺苷酸化序列）。 如本文中所使用，術語「以緘默方式改變」係指在不改變由編碼序列或經填充子插入之編碼序列編碼之多肽之胺基酸序列之情況下，基因之編碼序列或經填充子插入之編碼序列之變化（例如藉由核苷酸取代）。 此類緘默變化之有利之處在於，其可提高編碼序列之轉譯效率，及/或在編碼序列轉導至細胞中時防止與內源基因之相應序列之重組。 如本文中所使用，兩個核苷酸序列之間或兩個胺基酸序列之間的「一致性百分比」係藉由將所比對之序列對之間的匹配數目乘以100且除以所比對之區域之長度（包括內部間隙）來計算。 一致性評分僅對完美匹配進行計數，且不考慮胺基酸彼此之間的相似性程度。
本領域中熟習此項技術者將理解，此等TRE中之任一者可以任何順序組合，且組成性TRE及組織特異性TRE之組合可驅動有效及組織特異性轉錄。 在某些具體實施例中，SapB編碼序列編碼包含SapB蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。 在某些具體實施例中，SapB編碼序列編碼野生型SapB蛋白質（例如人類SapB蛋白質（hSapB））之胺基酸序列。 在某些具體實施例中，SapB編碼序列編碼突變型SapB蛋白質（例如人類SapB蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型SapB多肽為野生型SapB多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型SapB多肽。 在某些具體實施例中，功能上等效的SapB多肽進一步包含至少一種未在野生型SapB多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。 分子療法 在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼包含SUMF1蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。
在以人類設計載體處理之小鼠中，血清Phe含量在施用載體後的一週時間點減少（圖11B）。 對於經處理之第4及10週齡小鼠（第10組及第11組），Phe含量之減少維持經過43週，顯示對治療反應的長期耐久性。 在經處理之2週齡小鼠（第9組），經過30週Phe含量維持在≤360 µM之臨床相對含量。 在第9組（經過30週）、第10組（經過42週）及第11組（經過42週）中觀察到血清Tyr濃度相應的增加（圖11D）。 此等數據顯示劑量為1E14 vg/kg之封裝於AAVHSC15內的人類設計載體足夠在幼鼠肝臟生長期間提供持續療效，且該效果在施用後維持至少30週。 圖11F顯示在第2、4及10週齡以人類設計載體處理之小鼠肝臟檢測到的載體基因體含量。
每100人中便發現1人具有攜帶者突變，且在美國每40,000名活新生兒中便有1名或在全世界每160,000名活新生兒中便有1名受影響。 本申請案含有序列表，其已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中（該ASCII複本創建於2020年4月16日，名為「705151_HMW-030-6_ST25.txt」且大小為295,995個位元組）。 實際上，根據前文描述及附圖，除所描述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。 血液Phe含量在施用封裝於AAVHSC15衣殼內的PAH-006m兩週後減少至正常含量，如圖3中所示。
啟動子及強化子元件無需來源於相同基因或物種，且每個啟動子或強化子元件之序列可與基因組中之相應內源序列一致或實質上一致。 圖 11A-11K顯示為對單一劑量之小鼠特異性基因轉移／基因編輯AAV載體（PAH-006m-LP-1；「小鼠設計」）或人類特異性基因轉移／基因編輯AAV載體（hPAH-hI1C-032-LP1-SD3；「人類設計」）具有反應之PAHenu2小鼠年齡的圖。 隨時間推移而檢測在表2中所闡述的不同劑量組別之血清Phe及Tyr含量（圖 11A-11D）及載體基因體及mRNA含量（圖 11E-11K）。 圖9E及9F顯示按指定劑量給予游離轉基因表達載體（圖9E）或PAH-006m-LP1（圖9F）劑量之PAHenu2小鼠的載體基因體含量，其在每個情況下封裝於AAVHSC15衣殼內。
在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼野生型SUMF1蛋白質（例如人類SUMF1蛋白質（hSUMF1））之胺基酸序列。 在某些具體實施例中，SUMF1編碼序列編碼突變型SUMF1蛋白質（例如人類SUMF1蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型SUMF1多肽為野生型SUMF1多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型SUMF1多肽。 在某些具體實施例中，功能上等效的SUMF1多肽進一步包含至少一種未在野生型SUMF1多肽中發現之特徵，例如抵抗蛋白質降解之能力。 在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼包含ARSA蛋白質之全部或實質上全部胺基酸序列之多肽。 在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼野生型ARSA蛋白質（例如人類ARSA蛋白質）之胺基酸序列。 在某些具體實施例中，ARSA編碼序列編碼突變型ARSA蛋白質（例如人類ARSA蛋白質）之胺基酸序列，其中突變型ARSA多肽為野生型ARSA多肽之功能等效物，亦即，可充當野生型ARSA多肽。
使用PAHenu2小鼠模型通過測量載體基因體、靶基因插入百分比、hPAH mRNA表達及Phe/Tyr濃度用來對封裝於AAVHSC15衣殼之PAH校正載體建立劑量反應。 在封裝系統之某些實施例中，第一、第二及/或第三載體含於一或多種重組輔助病毒內。 在某些實施例中，用本文所揭示之AAV組成物轉導細胞可如本文所提供或藉由一般熟習此項技術者已知之任何轉導方法進行。 因此，在某些實施例中，該方法應用於肝臟、腎臟、腦、腦下垂體、腎上腺、胰腺、膀胱、膽囊、結腸、小腸或乳房中的細胞。 如本文所用，術語「聚腺苷酸化序列」係指當轉錄成RNA時構成聚腺苷酸化信號序列的DNA序列。 外源性聚腺苷酸化序列可為哺乳動物或病毒聚腺苷酸化序列（例如SV40聚腺苷酸化序列）。
- 本文中所揭示之方法的有利之處尤其在於其能夠活體內及活體外在細胞中以高效率表現ARSA蛋白質。
- 在某些實施例中，核苷酸長度的不對稱性是由5’及3’同源臂在長度上高達90%的差異所定義的，例如長度差異高達80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%。
- 已證實鞘脂激活蛋白B（SapB）可刺激半乳糖-腦甘脂硫酸酯由ARSA進行之水解、GM1神經節苷脂由β-半乳糖苷酶進行之水解及球形三醯神經醯胺由α-半乳糖A進行之水解。
- 廣泛偵測到抗小鼠ARSA（mARSA）或人類ARSA（hARSA），包括（但不限於）運動及感覺皮質、海馬區（CA3區域）、殼核及小腦。
- 在某些實施例中，第四核苷酸序列包含一或多種來自選自由以下組成之群的病毒的基因：腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒及巨細胞病毒。
圖 17為顯示投與封裝於AAVHSC15衣殼中之pHMI-5005的非人類靈長類動物之中樞神經系統（CNS）及腦脊髓液（CSF）中之ARSA活性之圖。 本文中所引用之所有參考文獻（例如公開案或專利案或專利申請案）皆以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中，其併入程度如同各個別參考文獻（例如公開案或專利案或專利申請案）具體且個別地指示為出於所有目的以全文引用之方式併入一般。 本文中所揭示之載體可封裝於AAV衣殼中，諸如（但不限於）AAVHSC5、AAVHSC7、AAVHSC15或AAVHSC17衣殼。
此種在苯丙胺酸代謝中之異常損害神經元成熟及髓磷脂的合成，導致智能障礙、癲癇及其他嚴重的醫學問題。 分子療法 本申請案含有序列表，其已經以ASCII格式之電子方式提交，且以全文引用之方式併入本文中（該ASCII複本創建於2021年5月24日，名稱為「 HMW-040PC SL.txt」且大小為213,352個位元組）。 來自美國參與此研究的論文第一作者莫里斯（Kevin Morris）表示，此療法對抗所有乙型冠狀病毒皆有效，包括十八年前引發恐慌的嚴重急性呼吸道症候群（SARS）冠狀病毒，及目前肆虐全球的新冠病毒。
此方法可進一步包含額外的qPCR或ddPCR（在相同反應亦或分別反應）以判定在樣品中的總基因體數目及未編輯的PAH等位基因數目。 本文所揭示之rAAV基因體所使用的同源臂可直接傳送到PAH基因的任何區域或基因體附近的基因。 準確的一致性及同源臂位置由編輯元件及/或靶基因座的一致性判定。 分子療法 在某些實施例中，rAAV基因體進一步包含至少一部分PAH編碼序列5’端的內含子元件。 此類內含子元件可增加轉基因表現，例如藉由減少轉錄緘默及增強自細胞核至細胞質之mRNA輸出。 在某些實施例中，rAAV基因體自5’至3’包含：TRE、內含子及至少一部分PAH編碼序列。
在某些實施例中，內含子元件為包含來自同一物種不同基因之至少一部分內含子序列的外源性內含子元件。 在某些實施例中，內含子元件為包含合成內含子序列的外源性內含子元件。 在某些實施例中，內含子元件為包含來自不同物種或來自同一物種的不同基因的至少一種內含子序列之組合及/或合成內含子序列的外源性內含子元件。 如本文所用，術語「在標準AAV施用條件下」係指轉導在肝細胞消融後移植入小鼠中的人類肝細胞，其中AAV係以每公斤體重1 × 1013載體基因體的劑量靜脈內施用。
每組三隻雄性小鼠施用封裝於AAVHSC15衣殼之PAH-006m 1E+14 vg/kg、或製劑緩衝液，以及每週測量血液Phe含量共12週。 在第12週時間點，犧牲小鼠以測量在PAH基因座的靶插入及mRNA表現含量。 在另一態樣中，本發明提供用於重組製備本文所揭示之重組腺相關病毒的封裝系統。
在某些具體實施例中，尤其感興趣的是需要活性內源ARSA之中樞神經系統及/或周邊神經系統之細胞。 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是前腦、中腦、後腦、脊髓及其任何組合中之細胞。 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是選自由以下組成之群組之中樞神經系統區域之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、丘腦、海馬區、殼核、小腦（例如小腦核）及其任何組合。 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是腦中之腦橋及髓質、脊髓之上升束及其任何組合中之細胞。 在某些具體實施例中，尤其感興趣的是選自由以下組成之群組之中樞神經系統區域中的需要活性內源ARSA之細胞：脊髓、運動皮質、感覺皮質、丘腦、海馬區、殼核、小腦（例如小腦核）及其任何組合。