一種用於抑制患者體內投與之神經細胞群之小神經膠質細胞吞噬作用的方法，其包含向該患者投與治療有效量之神經細胞群，該神經細胞群包含外源性CD47多肽及表現減少之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。 為了表徵及監測DA分化且評估DA表型，可評估任何數目之分子及遺傳標記之表現。 分子標記之表現可藉由定量方法測定，諸如但不限於基於qPCR之分析、免疫分析、免疫細胞化學分析、免疫墨點分析及其類似方法。 在一些實施例中，DA神經元表現選自絲胺酸蛋白酶、FOXA2、TuJ1、NURR1及其任何組合之標記中之一或多者。 本文提供自幹細胞活體外分化之多巴胺神經元，其中該多巴胺神經元表現外源性CD24多肽，其中該多巴胺神經元具有降低表現量之B2M及CIITA，且其中該多巴胺神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 本文提供自幹細胞活體外分化之多巴胺神經元，其中該多巴胺神經元表現外源性CD47多肽，其中該多巴胺神經元具有降低表現量之B2M及CIITA，且其中該多巴胺神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
在一些情況下，在向個體投與後，低免疫原性細胞及其衍生物經歷減少之T細胞及/或NK細胞殺滅。 在一些情況下，細胞及其衍生物顯示與未經修飾或野生型細胞相比減少之巨噬細胞吞噬。 在一些實施例中，與對應未經修飾之野生型細胞相比，低免疫原性細胞在接受個體中引發減少或減弱之免疫反應。 在一些實施例中，低免疫原性細胞無免疫原性或未能在接受個體中引發免疫反應。 在各種實施例中，在投與該神經細胞群之前不向該患者投與免疫抑制劑。 在某些實施例中，在投與該神經細胞群之後不向該患者投與免疫抑制劑。
分子治療: 接種疫苗
本文描述用於降低MHC I類及/或II類人類白血球抗原之含量及增加CD47及CD24之表現的方法。 低免疫原性神經細胞衍生自富潛能幹細胞，包括但不限於逃避接受個體之免疫識別或免疫反應之富潛能幹細胞及誘導性富潛能幹細胞。 此類低免疫原性神經細胞可以逃避經受體內神經免疫細胞之吞噬作用。 在一些實施例中，低免疫原性神經細胞在投與至接受個體後逃避小神經膠質細胞介導之自身殺滅。
在本發明研究中，六十隻雄性Rag2-/-x FVIII-/-小鼠在研究起始時為大致8週齡。 動物隨機分為六組(每劑量10隻動物)且經由尾端靜脈投予AAV5-FVIII-SQ之單次靜脈內注射(媒劑，2E12、6E12、2E13、6E13及2E14 vg/kg AAV5-FVIII-SQ)。 移除培養基且細胞經溶解(或若不立即使用，則細胞團塊儲存於-20℃下)。 抽吸來自細胞之培養基，轉染溶液添加至細胞且細胞在28℃下培育大致5小時。
分子治療: 疫苗安全
如請求項10之用途，其中所述藥物與濃度介於5毫克/天至60毫克/天範圍內的皮質類固醇一起預防性地投予。 如請求項1之醫藥調配物，其包含濃度為約1.42mg/ml之二元磷酸鈉、濃度為約1.38mg/ml之單水合一元磷酸鈉、濃度為約8.18mg/ml之氯化鈉、濃度為約20mg/ml之甘露糖醇及濃度為約2mg/ml之泊洛沙姆188。 對於各劑量，若活性水準達到5 IU/dL且若未發現安全性問題，則至多四個患者將接受此劑量。 若活性水準在任何時間達到10 IU/dL或更高，則將不進行進一步劑量遞增，而是其他患者將接著以此劑量水準投藥，每劑量總共6個患者。
本文提供一種自幹細胞活體外分化之小神經膠質細胞，該小神經膠質細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該小神經膠質細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 更特定言之，Rag2小鼠以6E12 vg/kg、2E13 vg.kg或6E13 vg/kg之劑量投予單次劑量之AAV5-FVIII-SQ病毒或AAV5-p100ATGB-FVIII病毒且隨後在小鼠之血流中測定FVIII蛋白濃度。 此等分析之結果展示投予AAV5-p100ATGB-FVIII病毒產生相比於兩個較低測試劑量下之AAV5-FVIII-SQ病毒高大致3倍的循環功能FVIII蛋白含量。 觀測的表現差異在最高測試劑量下略微減少，儘管即使在最高測試劑量下，AAV5-p100ATGB-FVIII病毒產生相比於AAV5-FVIII-SQ病毒較高的循環功能FVIII蛋白含量。 此等結果展示 分子治療 AAV5-p100ATGB-FVIII病毒有效地在活體內轉導肝臟細胞且提供高功能FVIII蛋白含量之表現。 為了展示本發明之重組AAV FVIII載體確實包裝編碼FVIII之核酸，如實例1及2中所述產生之雙鏈形式之AAV FVIII載體引入至能夠產生AAV病毒粒子之細胞中。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
如請求項1至8中任一項之方法，其中在該患者經歷繼發於神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期存活。 [圖11]為一組代表性FACS曲線圖，其顯示如實例6中所描述之野生型iPSC、dKO/CD47Tg iPSC、自此類野生型iPSC分化之多巴胺先驅細胞及自此類dKO/CD47Tg iPSC分化之多巴胺先驅細胞中的CD47表現。 [圖1]顯示野生型人類EC、雙基因剔除(B2M-/-CIITA-/-)EC及雙基因剔除/CD47Tg(B2M-/-CIITA-/-CD47 tg；dKO/CD47Tg)EC。 EC與同種異體人類巨噬細胞或小神經膠質細胞共培養以觀察CD47表現對小神經膠質細胞抑制之效應。 CD47似乎亦保護dKO/CD47Tg細胞免於小神經膠質細胞之吞噬作用。
- 若干毒性終點組合為一個小鼠研究(組織學)及三個猴研究(臨床病理學)以跨越兩個物種評估劑量關係。
- 短暫轉染之293細胞或桿狀病毒感染之Sf9細胞中產生之所得AAV病毒粒子藉由此項技術中已知之標準方法純化及分析。
- 在一些實施例中，Cas蛋白質包含本文所描述之Cas蛋白質中之任一者或其功能性部分。
- 在多種情況下，將低免疫原性神經細胞植入至接受個體之神經系統(諸如中樞神經系統及周邊神經系統)中，且不藉助於巨噬細胞或小神經膠質細胞吞噬作用或兩者消除。
- 本文提供包含調節MHC I及/或MHC II之表現的一或多個靶向多核苷酸序列之修飾的細胞。
- 在一些實施例中，在投與該神經細胞群之前不向該患者投與免疫抑制劑。
在一些實施例中，包括寡樹突神經膠質細胞、星狀細胞之神經膠質細胞及其先驅細胞不表現選自以下之標記中之一或多者：PSA-NCAM、CD9、CD11、cD32、CD36、CD105、CD140a、巢蛋白、PDGFαR及其類似者。 在一些實施例中，使用陽性選擇策略、陰性選擇策略或兩者選擇或純化神經膠質細胞。 測定神經細胞是否逃避免疫識別之方法包括但不限於IFN-γ Elispot分析、小神經膠質細胞殺滅分析、細胞植入動物模型、細胞介素釋放分析、ELISA、使用生物發光成像之殺滅分析或鉻釋放分析或Xcelligence分析、混合淋巴細胞反應、免疫螢光分析等。 應注意，申請專利範圍可經起草以排除任何視情況選用之要素。 因此，此陳述意欲與對所主張要素之敘述結合充當使用諸如「僅僅」、「僅」及其類似術語之排他性術語或使用「否定性」限制之前提基礎。 如本領域中熟習此項技術者在閱讀本發明之後將顯而易知，本文中所描述及說明之個別實施例中之每一者具有離散組分及特徵，其可容易地與其他若干實施例中之任一者之特徵分離或與其組合，而不脫離本發明技術之範疇或精神。
分子治療: 核酸医薬
在一些實施例中，核糖核酸中之至少一者包含引導RNA，該引導RNA將Cas蛋白質引導至細胞中之目標多核苷酸序列之目標模體且與其雜交。 在一些實施例中，一至兩種核糖核酸中之兩者均包含引導RNA，該引導RNA將Cas蛋白質引導至細胞中之目標多核苷酸序列之目標模體且與其雜交。 如本領域中熟習此項技術者將瞭解，視所用特定CRISPR/Cas系統及目標多核苷酸之序列而定，可選擇核糖核酸以雜交至多種不同目標模體。 亦可選擇一至兩種核糖核酸以使與除目標多核苷酸序列以外之核酸序列之雜交最小化。
本發明亦關於包含本文中描述之AAV FVIII載體之重組AAV病毒粒子及其用於治療A型血友病之用途。 如本文所用之術語「反向末端重複序列」係指以順式起DNA複製源及病毒基因組之包裝信號作用之AAV基因組之5’及3’端處發現之技術認可的區域。 AAV ITR連同AAV rep編碼區提供自插入兩個側接ITR之間的核苷酸序列之有效切除及解救，且將所述核苷酸序列整合至宿主細胞基因組中。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
作為另一實例，負責使病原體進入或增殖至細胞中之目標基因之多核苷酸序列可為刪除或插入以破壞目標基因之功能以防止病原體進入細胞或在細胞內增殖之適合目標。 在一些態樣中，本發明提供幹細胞(例如富潛能幹細胞或誘導性富潛能幹細胞)或其群體，其包含其中基因已經編輯以刪除基因體DNA之連續片段，藉此減少或消除MHC I類分子在該細胞或其群體中之表面表現的基因體。 在某些態樣中，本發明提供幹細胞(例如富潛能幹細胞或誘導性富潛能幹細胞)或其群體，其包含其中基因已經編輯以刪除基因體DNA之連續片段，藉此減少或消除MHC II類分子在該細胞或其群體中之表面表現的基因體。 在特定態樣中，本發明提供幹細胞(例如富潛能幹細胞或誘導性富潛能幹細胞)或其群體，其包含其中一或多個基因已經編輯以刪除基因體DNA之連續片段，藉此減少或消除MHC I類及II類分子在該細胞或其群體中之表面表現的基因體。 在一些實施例中，根據如藉由免疫細胞測量術及免疫組織化學所測定之形態表徵神經膠質細胞。
- 本發明亦關於治療罹患A型血友病之個體之方法，其包含以下步驟：向所述個體投予治療有效量之重組AAV FVIII病毒，及在投予所述治療有效量之所述重組AAV FVIII病毒之後，測定所述個體之血清中不存在 或存在抗AAV衣殼抗體。
- 構成HLA複合體之此等細胞表面蛋白質負責調節對抗原之免疫反應。
- 第二天，孔用綠色稀釋劑封閉，且來自第4組及第6組之小鼠血漿樣品(50μl)或用Xyntha加標的正常小鼠血漿樣品(500ng/ml)用相同體積之綠色稀釋劑稀釋且100μl混合物添加至個別孔以富集FVIII重鏈或輕鏈。
- 動物分為四組且以單次緩慢團式注射靜脈內投予形式給予2.0E12或2.0E13 vg/kg AAV5.2-hFVIII-SQ或AAV8.2-hFVIII-SQ(分別為0.5及5.0mL/kg)。
在動物模型及人類患者中均存在大量證據表明，神經細胞移植為一種在科學上可行且在臨床上有前景之治療神經病症及病況之方法。 如請求項43之用途，其中投予所述藥物導致所述個體中至少約1 IU/dl 功能因子VIII蛋白之表現。 此研究之次要目標為描述全身性投予重組FVIII AAV病毒後，對FVIII轉殖基因及/或AAV衣殼蛋白之免疫反應，評估FVIII AAV投配對研究期間的FVIII置換療法頻率之影響，及評估投配對研究期間需要治療之出血事件數目的影響。 1/2期人類臨床試驗之所提出起始劑量6E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ係基於亦在猴及小鼠中具有可偵測血漿FVIII-SQ蛋白及活性水準之10倍安全係數選擇，降低治療 不佳結果之可能性。 此研究之目標為在以單次靜脈內投予形式給予食蟹獼猴時，經8週評估兩個細胞株(桿狀病毒感染之sf9昆蟲及人類293細胞)中產生之兩個製造批次之AAV5-FVIII-SQ之相對活性。
分子治療: Taxes and tax credits
在某些實施例中，包含治療有效量之用於減少出血時間之AAV FVIII病毒之組合物於包含用於預防及/或 治療與投予如上文所述之AAV FVIII病毒相關之任何肝毒性之預防性及/或治療性皮質類固醇之組合物一起投予。 在另一較佳實施例中，肝臟特異性轉錄調節區包含α1-微球蛋白增強子序列及186個鹼基之α抗-胰蛋白酶近端啟動子。 一種自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之神經細胞，該神經細胞表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之神經細胞，該神經細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
在第四態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：12中所闡述之核酸序列之構築體103ATG。 在第二態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID 分子治療 NO：10中所闡述之核酸序列之構築體100ATG bGH poly A。 在第一態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：9中所闡述之核酸序列之構築體100ATG。
分子治療: 核酸医薬
本文提供神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含經分離神經細胞，該經分離神經細胞包含外源性CD24多肽及表現減少之MHC I類人類白血球抗原及/或MHC II類人類白血球抗原，其中該經分離神經細胞在向患者投與時逃避免疫識別。 本文提供神經細胞用於治療神經疾病之用途，其包含經分離神經細胞，該經分離神經細胞包含外源性CD47多肽及表現減少之MHC I類及/或II類人類白血球抗原，其中該細胞在向患者投與時逃避免疫識別。 提供一種自幹細胞活體外分化之室管膜細胞，該室管膜細胞表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該室管膜細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 提供一種自幹細胞活體外分化之星狀細胞，該星狀細胞表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該星狀細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 提供一種自幹細胞活體外分化之許旺細胞，該許旺細胞表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該許旺細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 提供一種自幹細胞活體外分化之寡樹突神經膠質細胞，該寡樹突神經膠質細胞表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該寡樹突神經膠質細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。
如請求項131至144中任一項之方法，其中該神經細胞係選自由以下組成之群組：腦內皮細胞、神經元、室管膜細胞、星狀細胞、小神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞、許旺細胞、其先驅細胞及其前驅細胞。 分子治療 如請求項131至140中任一項之方法，其中該神經細胞群在投與後在該患者中存活及/或發揮功能至少一個月、兩個月、三個月、四個月或更長時間。 如請求項131至138中任一項之方法，其中在該患者經歷繼發於該神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。
分子治療: 接種疫苗
在一些情況下，MHC I類及/或II類人類白血球抗原之表現與未經修飾或野生型神經細胞相比減少。 分子治療 在一些實施例中，神經細胞展現增加之CD47或CD24表現。 在一些情況下，CD47之表現與未經修飾或野生型神經細胞相比增加。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
在第十二態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：20中所 闡述之核酸序列之構築體2× SerpinA hAAT ATG 分子治療 FVIII 2× μ-球蛋白增強子。 特定言之，AAV載體之選殖容量由於病毒之DNA包裝容量而受限。 在實踐中，達至約5.0kb之AAV基因組似乎完全包裝(即呈全長)至AAV病毒粒子中。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
在一些實施例中，根據功能性表徵分析，諸如但不限於神經元共培養分析、脂多醣之刺激分析、活體外髓鞘形成分析、ATP流入及鈣波振盪分析以及其類似分析，來評估神經膠質細胞。 在一些實施例中，將經分化DA神經元靜脈內移植或藉由在患者之特定位置處注射移植。 分子治療 在一些實施例中，將經分化DA細胞移植至腦部之黑質(特定言之，緻密區中或鄰近該區)、腹側被蓋區、尾狀核、殼核、伏隔核、丘腦下核或其任何組合中，以置換退化引起帕金森氏症之DA神經元。 替代地，經分化DA細胞在含於此類遞送裝置中時可嵌入於支撐基質或支架中。
分子治療: 疫苗安全
包含預防性或治療性皮質類固醇治療劑之組合物可包含每天至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或大於60毫克的皮質類固醇。 在某些實施例中，包含預防性或治療性皮質類固醇之組合物可經至少約3、4、5、6、7、8、9、10週或大於10週之連續時段投予。 本發明亦提供本發明之方法中的任一者，其進一步包含在投予所述治療有效量之所述重組AAV FVIII病毒之後測定所述個體之血清中不存在或存在抗AAV衣殼抗體之步驟。 另外，本發明提供本發明之方法中的任一者，其進一步包含在進行所述個體之血清中存在抗AAV衣殼抗體之測定之後向所述個體投予有效量的皮質類固醇之步驟。